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Sonderforschungsbereich 699

Strukturelle, physiologische und molekulare Grundlagen der Nierenfunktion

Projektbereich B: Endo- und parakrine Regulatoren der Nierenfunktion

Teilprojekt B2 (Physiologie, molekulare Physiologie)

Determinanten der Reninzellentwicklung
Das Phänomen der Rekrutierung reninbildender Zellen in der Niere zeigt sich zum einen während der Nierenentwicklung, wenn reninbildende Zellen erstmalig in der Wand großer präglomerulärer Gefäße auftreten und sich mit fortschreitender Nierenreifung allmählich in immer kleinere Arterien verlagern, bis sie im Adultzustand nur noch in der klassischen, juxtaglomerulären Position erhalten bleiben. Aber auch in der adulten Niere ist die Zahl reninbildender Zellen nicht konstant. Dies zeigt sich bei chronischer Stimulation der Reninsystems, wenn retrograd Zellen zur Reninsynthese befähigt werden. Die Faktoren, die dieses Phänomen steuern, sind bislang noch unzureichend untersucht.
In der laufenden F√∂rderperiode wurden die Entwicklung und Rekrutierung von reninbildenden Zellen unter dem Einfluss von Dopamin und den Gef√§√üwand-Differenzierungsfaktoren TGF-√ü und PDGF charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass Dopamin keine entscheidende Rolle bei der Rekrutierung von Reninzellen in unreifen Nieren und in der ausgereiften Niere spielt. F√ľr die Bedeutung von TGF-√ü und PDGF konnte nachgewiesen werden, dass die Differenzierung zur Reninzelle ohne den Einfluss des TGF-√ü Signalwegs erfolgt und dass die Integration der Reninzellen in die Gef√§√üwand nicht √ľber den klassischen, f√ľr die renale Gef√§√üneubildung beschriebenen PDGF-B PDGF-R√ü-Signalweg l√§uft.
Das Ziel dieses Projektes ist es nun, die Bedeutung von inhibitorischen Reninregulatoren zu klären, die die Rekrutierung von reninbildenden Zellen während der Nephrogenese und in der adulten Niere steuern. Es sollen in diesem Zusammenhang vasokonstriktorische Faktoren untersucht werden, die nachgewiesenermaßen hemmend auf das Reninsystem wirken. Dazu soll die Bedeutung von ANGII als klassischen negativen Regulator untersucht werden und es soll die Bedeutung von Endothelin betrachtet werden.
Projektleiter: Prof. Dr. Charlotte Wagner

Teilprojekt B3 (Physiologie)

Mechanismen der renalen kompensatorischen Hypertrophie
Der Verlust von funktionst√ľchtigem Nierengewebe f√ľhrt zu raschen und ausgepr√§gten Anpassungsvorg√§ngen der verbleibenden Nephrone. Dieser als renale kompensatorische Hypertrophie bezeichnete Prozess wird besonders nach unilateraler Nephrektomie, z.B. im Rahmen einer Nierenlebendspende, deutlich. Hier kommt es zu einer Gr√∂√üenzunahme sowie einer starken Zunahme der Funktion der verbliebenen Niere, so dass die glomerul√§re Filtrationsrate (GFR) des Nierenspenders bis zu 80% des Wertes vor Nierenentnahme, also mit zwei Nieren, betragen kann. Der Anstieg der GFR findet dabei zum gr√∂√üten Teil innerhalb der ersten Tage nach unilateraler Nephrektomie statt. Die Nierenfunktion bleibt anschlie√üend auch langfristig konstant, so dass das Risiko eines Nierenspenders, ein terminales Nierenversagen zu entwickeln, nicht h√∂her als in der Normalbev√∂lkerung ist. Obwohl in den letzten Jahrzehnten wesentliche Fortschritte im Verst√§ndnis der intrarenalen Regulationsmechanismen der kompensatorischen Hypertrophie erzielt wurden, sind die Signale, die den Verlust von Nierengewebe an die noch vorhandenen Nephrone vermitteln und somit die strukturelle und funktionelle Anpassung ausl√∂sen, weitgehend unbekannt.

In der laufenden F√∂rderperiode haben wir die Bedeutung der kardialen natriuretischen Peptide ANP und BNP und ihres gemeinsamen Rezeptors, der Guanylatzyklase-A (GC-A), f√ľr die renale kompensatorische Hypertrophie untersucht. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die natriuretischen Peptide tats√§chlich entscheidend f√ľr den raschen Anstieg der Nierenfunktion und f√ľr die parallel entstehende Hypertrophie des proximalen Tubulus in der Fr√ľhphase nach Uninephrektomie sind. Allerdings zeigen unsere Untersuchungen auch, dass natriuretische Peptide f√ľr die langfristige Anpassung der GFR und der Nierengr√∂√üe nach UNx entbehrlich zu sein scheinen.
Ziel der kommenden F√∂rderperiode wird es zum einen sein, das Zusammenspiel zwischen natriuretischen Peptiden und Nierenfunktion nach Uninephrektomie besser zu verstehen. Dar√ľberhinaus sollen weitere Faktoren, die die kompensatorische Hypertrophie kontrollieren identifiziert werden.
Wir erwarten durch unsere Untersuchungen ein besseres Verständnis der Regulation der GFR, insbesondere nach Uninephrektomie. Zudem könnten die Ergebnisse zur Aufklärung der Mechanismen, die die Nierenfunktion beim Nierenspender, trotz teils jahrzehntelanger glomerulärer Hyperfiltration, aufrecht erhalten, beitragen.
Projektleiter: Prof. Dr. Frank Schweda

Teilprojekt B5 (Pharmakologie, Physiologie)

Wirkung und Funktion renaler Prostaglandine
Prostaglandine sind eine Gruppe von Gewebshormonen, die in den Nieren die glomerul√§re Filtrationsrate (GFR), den renalen Blutfluss (RBF), die Salz- und Wasserausscheidung, sowie die Reninbildung und -freisetzung regulieren. Zudem sind sie wichtige Mediatoren inflammatorischer Prozesse. Mittels der Cyclooxygenase und nachgeschalteten Prostaglandinsynthasen werden sie aus ihrer Vorstufe, der Arachidons√§ure, synthetisiert. Das Enzym Cyclooxygenase (COX), von dem zwei Isoformen beschrieben sind, nimmt dabei eine entscheidende Stellung in der Biosynthese ein. W√§hrend COX-1 vorwiegend konstitutiv in fast allen Geweben gebildet wird, wird die COX-2 durch verschiedene Faktoren (z.B. Zytokine, oxidativer Stress) induziert und ist vor allem bei pathophysiologischen Prozessen (z.B. Entz√ľndungen), aber auch bei physiologischen Anpassungen aktiv.

In der ablaufenden F√∂rderperiode haben wir gefunden, dass eine Hemmung der COX-1 den fr√ľhen Abfall der GFR an endotox√§mischen M√§usen abschw√§cht. Im Gegensatz dazu bewirkt eine Hemmung der COX-2 eine Verschlechterung der GFR. Dies scheint die Folge einer verminderten Bildung an PGE2 zu sein, da Endotox√§mie zu einer Aktivierung des COX-2 → mPGES1 → PGE2 → EP2/4-Signalwegs f√ľhrt, welcher eine renale Vasodilatation bedingt. Zudem konnten wir zeigen, dass die Sekretion von Renin unabh√§ngig von Prostaglandinen √ľber Proteinase-aktivierte Rezeptoren moduliert wird: w√§hrend eine Aktivierung von PAR1 die Reninsekretion hemmt, wird diese durch eine Aktivierung von PAR2 stimuliert.

Bisher nahm man an, dass die physiologische, endotheliale Bildung von Prostazyklin √ľber COX-2 erfolgt und dass COX-2 die entscheidende Isoform f√ľr die Bildung von Prostaglandinen bei entz√ľndlichen Vorg√§ngen ist. Deswegen fokussierte man sich unter anderem in den letzten Jahren haupts√§chlich auf diese Isoform. J√ľngste Arbeiten zeigen aber, dass die endotheliale Bildung von Prostazyklin fast ausschlie√ülich √ľber COX-1 erfolgt und dass der COX-1 eine sehr wichtige Funktion bei der schnellen Bildung an Prostanoiden nach Aktivierung des Inflammasoms zuzuordnen ist. Daraus k√∂nnte man folgern, dass eine Hemmung der COX-1 in der Fr√ľhphase von inflammatorischen Prozessen protektive Wirkungen besitzt.

Ziel des Projektes ist es daher, die Bedeutung von √ľber COX-1 gebildeten Prostaglandinen hinsichtlich der Nierenfunktion genauer zu charakterisieren. Insbesondere soll die Funktion von COX-1 gebildeten Prostaglandinen f√ľr das akute Nierenversagen im Allgemeinen und w√§hrend experimenteller Sepsis untersucht werden. Zudem m√∂chten wir neue Modelle f√ľr das akute Nierenversagen bei Sepsis etablieren und dort die Bedeutung von Inhibitoren der Cyclooxygenase, insbesondere von Aspirin, bzw. von einzelnen Prostanoiden untersuchen.

Wir erwarten uns aus dem Projekt zum einen grundlegende Informationen √ľber die Funktion von COX-1 gebildeten Prostaglandinen f√ľr die Nierenfunktion. Zum anderen erhoffen wir uns m√∂gliche Ansatzpunkte daf√ľr zu erhalten, inwiefern Prostaglandine wichtig f√ľr die Pathogenese von akuten, inflammatorischen Nierenerkrankungen sein k√∂nnten, was aus therapeutischer Sicht interessant sein k√∂nnte.
Projektleiter: Prof. Dr. Klaus Höcherl

Teilprojekt B6 (Physiologie, molekulare Physiologie)

Zelluläre Mechanismen der Reninsekretion
Die Sekretion von Renin aus den reninbildenden Zellen der Niere ist der entscheidende regulatorische Schritt f√ľr die Aktivit√§t des systemischen Renin-Angiotensin-(Aldosteron)-Systemes.
In der laufenden F√∂rderperiode wurden die Reninspeicherstrukturen und ihr Verhalten bei Stimulation der Reninsekretion charakterisiert. Dabei zeigte sich, dass Reninspeichervesikel in komplexen Raumstrukturen auftreten k√∂nnen, die bei Stimulation der Sekretion zu gro√üen zisternenartigen Strukturen verschmelzen. Diese bilden auch punktuelle Kontakte mit der Plasmamembran, und entleeren wahrscheinlich √ľber Exozytose ihren Inhalt in den Extrazellul√§rraum. Gesamthaft lassen sich die Abl√§ufe morphologisch gut als Form der compound Exozytose beschreiben, die im Falle des Renins durch Aktivierung der Protein Kinase A induziert wird.

Angiotensin II, welches als Konsequenz aus der Aktivit√§t freigesetzten Renins entsteht, hemmt die Sekretion von Renin schnell und stark. Entsprechend f√ľhrt die Verabreichung von Hemmstoffen der Angiotensin II Rezeptoren bzw. der Angiotensin II- Bildung auch beim Menschen zu einer kr√§ftigen und dauerhaft anhaltenden Enthemmung der Reninsekretion was zum einen die therapeutische Wirksamkeit solcher im Sinne eines Escape mindern kann und zum anderen zur Freisetzung der vesikul√§ren ‚ÄěBeiprodukte‚Äú von Renin f√ľhrt, deren Natur und Wirkungen noch nicht identifiziert sind. Die Mechanismen, √ľber welche Angiotensin II die Reninsekretion hemmt, sind weitgehend unbekannt, abgesehen von einer klaren Abh√§ngigkeit von der extrazellul√§ren Kalziumkonzentration, wodurch Kalzium eine offensichtlich inhibitorische Rolle bei der Reninsekretion spielt. Eine Hemmung der Sekretion durch Kalzium ist aus zellbiologischer Sicht sehr ungew√∂hnlich und ist im Falle der Reninsekretion auch mechanistisch noch nicht verstanden. Dieses Teilprojekt soll sich daher der Aufkl√§rung der Mechanismen widmen, √ľber welche Angiotensin II/ Kalzium die Reninsekretion hemmen und es sollen die Vesikelinhalte bestimmt werden, welche zusammen mit Renin bei RAAS-Blockade freigesetzt werden. Es soll deshalb in Fortsetzung der bisherigen Untersuchungen die Ultrastruktur reninbildender Zellen bei akuter Angiotensin II induzierter Hemmung bestimmt werden um zu sehen, wie sich die Membrankontakte der Vesikel und die Vesikelstrukturen daraufhin ver√§ndern (Ziel 1). Weiterhin sollen die der Angiotensin II/ Kalzium induzierten Hemmung der Reninsekretion zugrunde liegenden Mechanismen systematisch untersucht werden um eine erkl√§rende Antwort auf dieses seit Jahrzehnten bekannte aber nach wie vor unbefriedigend entschl√ľsselte Ph√§nomen zu finden (Ziel 2). Das dritte Ziel (Ziel 3) widmet sich der Analyse des Vesikelinhaltes und der Vesikelmembranen der gro√üen polymorphen Vesikeln in reninbildenden Zellen. In der zur√ľckliegenden F√∂rderperiode haben wir Mausmodelle generiert bzw charakterisiert, welche eine stark erh√∂hte Zahl von reninbildenden Zellen enthalten. Aus den Nieren solcher Tiere sollen Reninzellen mit gro√üer Reninheit isoliert werden und die Reninspeichervesikel aus diesen Zellen sollen isoliert und eine Proteinanalyse durchgef√ľhrt werden.

Wir erwarten aus dem Projekt zum einen Grundlageninformation √ľber eine ungew√∂hnliche Sekretionskontrolle. Zum anderen hoffen wir m√∂gliche Ansatzpunkte daf√ľr zu erhalten, wie die Sekretion von Renin selektiv gehemmt werden k√∂nnte, was aus therapeutischer Sicht interessant sein k√∂nnte, da die bisherigen Antagonisten des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Sytemes allesamt zu einer reaktiven Reninhypersekretion f√ľhren, was deren Wirksamkeit begrenzt und noch unerkl√§rte Nebeneffekte erzeugen k√∂nnte.
Projektleiter: Prof. Dr. Armin Kurtz

Teilprojekt B7 (Physiologie)

Untersuchung der Bedeutung von Angiotensin Rezeptoren und Angiotensin Rezeptor-assoziierten Proteinen f√ľr die Funktion und Struktur des Glomerulums
In der laufenden F√∂rderperiode wurde die Regulation des Renin Angiotensin-Systems auf Ebene seiner Rezeptoren (AT1 und AT2 Rezeptoren) untersucht. Wir konnten zeigen, dass neben der systemisch wirksamen Regulation des RAS auf Ebene der Sekretion ein weiteres, lokales Regulationsprinzip auf Ebene der AT1 Rezeptoren existiert, das ma√ügeblich von der Interaktion des AT1 Rezeptors mit akzessorischen Proteinen gepr√§gt ist. Diese mit dem AT1 Rezeptor assoziierten Proteine modulieren lokal und zeitlich variabel die Sensitivit√§t der Zielzellen f√ľr Angiotensin II.

In der beantragten Fortsetzungsperiode soll nun der Fokus auf die Bedeutung der AT Rezeptoren und ihrer assoziierten Proteine f√ľr die Funktion und Struktur des Glomerulums gelegt werden. Da diese Struktur bisher f√ľr direkte Untersuchungen in vivo nur schlecht zug√§nglich war, w√§hlen wir einen neuen methodischen Ansatz: Die Versuche sollen im Wesentlichen mittels intravitaler Zweiphotonen-Mikroskopie (2P-Mikroskopie) durchgef√ľhrt werden, um am lebenden Tier in Echtzeit die Effekte von Angiotensin II auf die Struktur und die Funktion des Glomerulums untersuchen zu k√∂nnen. Angesichts des komplexen strukturellen und funktionellen Zusammenspiels der Zellen des Glomerulums sowie der vor- und nachgeschalteten Arteriolen erwarten wir von in situ Untersuchungen mittels Intravital-Mikroskopie einen idealen neuen methodischen Zugang f√ľr die Bearbeitung unserer Fragestellung.

Wir erhoffen uns von diesem Projekt einen substantiellen Fortschritt f√ľr das Verst√§ndnis der Physiologie und Pathophysiologie des Glomerulums und erwarten neue Erkenntnisse hinsichtlich der Wirkung von Angiotensin II auf die GFR und auf die Funktion der Filtrationsbarriere. Mit AT Rezeptoren assoziierte Proteine k√∂nnten in diesem Zusammenhang ein neues Target f√ľr eine pharmakologische Modulation der Effekte des RAS darstellen.
Projektleiter: Prof. Dr. Wolf Hayo Castrop

Teilprojekt B9 (Pharmakologie, Signaltransduktion in der Niere)

Funktion der cGMP-abhängigen Proteinkinasen in der Niere
Der Second Messenger cGMP wird durch l√∂sliche Guanylylzyklase nach NO-Aktivierung sowie durch partikul√§re Guanylylzyklase nach Aktivierung durch natriuretische Peptide gebildet. cGMP f√ľhrt zur Aktivierung der cGMP-abh√§ngigen Proteinkinasen cGKIalpha, cGKIbeta und cGKII. NO reguliert die renale H√§modynamik. Sowohl NO als auch natriuretische Peptide sind an Natriurese und Diurese beteiligt.
Die Funktionen von cGMP und cGMP-abh√§ngigen Proteinkinasen in der Niere sind weitgehend ungekl√§rt. Um eine Basis f√ľr funktionelle Untersuchungen der renalen cGMP-Signaltransduktion zu erhalten, wurde die Lokalisation der cGKIalpha, cGKIbeta sowie des cGK-Substratproteins IRAG immunhistochemisch analysiert. cGKIalpha und cGKIbeta werden in pr√§glomerul√§ren Gef√§√ümuskelzellen, Mesangialzellen sowie kortikalen tubulointerstitiellen Zellen exprimiert. cGKIalpha ist zus√§tzlich in medull√§ren interstitiellen Zellen sowie in reninbildenden Zellen lokalisiert. IRAG wird in Arteriolen sowie in Mesangialzellen gefunden. In weitergehenden Untersuchungen analysierten wir die Effekte von cGK auf die interstitielle Fibrose, auf die Salz-Wasser-Bilanzierung, sowie auf die Reninsekretion. F√ľr diese funktionellen Analysen wurden cGK-Knockout, cGKIRescue-Mutanten sowie Knockout-Mutanten des cGK-Substratproteins IRAG verwendet.

Unsere Untersuchungen zeigten, dass cGKI-Aktivierung in interstitiellen Fibroblasten und Myofibroblasten die Progression einer renalen Fibrose unterdr√ľckt. cGKII ist nach unseren Untersuchungen an der Diurese und Natriurese beteiligt, die durch Volumenbelastung verursacht wird. In cGKII-Knockout-M√§usen wurde im Modell der isoliert perfundierten Niere bislang keine wesentliche Rolle von cGKII bei der Kontrolle der Reninsekretion deutlich.

In der Fortsetzungsperiode soll nun die Rolle von cGKI in den interstitiellen Zellen sowie in reninbildenden Zellen definiert werden. Die m√∂gliche Bedeutung von cGKI f√ľr die Reninsekretion und Reningenexpression wird mit Reninzell-spezifischen cGKI-Mutanten analysiert. Au√üerdem wird die Lokalisation und Funktion von cGKI in renalen interstitiellen Zellen sowohl physiologisch als auch bei der Nierenfibrose weitergehend charakterisiert. Dazu wird einerseits die Lokalisation der cGKI mit Proteinen interstitieller Zellen und des cGMPbildenden Systems verglichen. Andererseits sind Untersuchungen mit Zelltyp-spezifischen cGKI-KO-Mutanten (u.a. in Myofibroblasten) geplant. Die Lokalisation von cGKII in der Niere wird mit spezifischen Antik√∂rpern n√§her charakterisiert. Potentielle Substratproteine der cGKII in renalen Zellen werden anschlie√üend durch Interaktions- und Phosphoproteom-Analyse identifiziert.
Projektleiter: Prof. Dr. Jens Schlossmann