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Sonderforschungsbereich 699

Strukturelle, physiologische und molekulare Grundlagen der Nierenfunktion

Projektbereich A: Glomeruläre und tubuläre Funktion

Teilprojekt A3 (Physiologie)

Pathophysiologie der Salzverlustsyndrome durch Mutationen der einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanäle KCNJ10 und KCNJ16
Gemeinsam mit Prof. Kleta, University College London, haben wir 2009 ein neues autosomal rezessives Salzverlustsyndrom beschrieben, welches aufgrund der Symptome Epilepsie, Ataxie, sensorineurale Taubheit und Tubulopathie EAST-Syndrom genannt wurde. Das EAST-Syndrom wird durch loss-of-function Mutationen im Kaliumkanal KCNJ10 verursacht. In der vergangenen Antragsperiode haben wir begonnen, die Rolle von KCNJ10 und seines Partnerproteins KCNJ16 in der Niere mit Hilfe neuer Mausmodelle zu untersuchen. Basierend darauf möchten wir in der kommenden Antragsperiode folgende Fragen bearbeiten:

1. Genotyp-Phänotyp-Korrelation bei KCNJ10-Mutationen
Auf welchen molekularen Mechanismen beruhen die Unterschiede der klinischen Symptomatik bei Patienten mit EAST-Syndrom? Unterschiedliche Mutationen von KCNJ10 k√∂nnen zu spezifischen Defekten f√ľhren. Mit Hilfe elektrophysiologischer und fluoreszenzoptischer Methoden sollen neue Mutanten untersucht und der Genotyp mit dem in vitro Ph√§notyp und der klinischen Symptomatik in Zusammenhang gesetzt werden.
2. KCNJ16: Ein neues Kandidatengen f√ľr eine distale Tubulopathie
Unsere klinischen Kooperationspartner Prof. Konrad und Prof. Waldegger haben bei einem Patienten mit Salzverlustsyndrom und weiteren extrarenalen Symptomen eine homozygote KCNJ16 Mutation gefunden. Nun soll gekl√§rt werden, ob diese Mutation tats√§chlich f√ľr die Entstehung des Krankheitsbildes verantwortlich ist. Erg√§nzend zu in vitro Versuchen soll mit Hilfe der KCNJ16-Knockoutmaus vergleichend untersucht werden, ob die Erkrankung einer "loss-of-function" oder einer "gain-of-function" Mutation entspricht.
3. Analyse der KCNJ10/KCNJ16-Heteromerfunktion mittels induzierbarem Doppelknockout
Es ist bekannt, dass KCNJ10 im distalen Tubulus der Niere mit der Untereinheit KCNJ16 heteromere Kanäle bildet. Wir möchten die Funktion heteromerer KCNJ10/KCNJ16-Kanäle in der Niere untersuchen, ohne dass zur Bildung homomerer oder unphysiologisch-heteromerer Kanäle kommen kann.

Wir erhoffen uns, durch diese Versuche ein besseres Verständnis der molekularen Pathophysiologie dieser neuen Salzverlustsyndrome zu erhalten. Fernziel ist, durch Kenntnis der molekularen und zellulären Zusammenhänge renale Salzverlustsyndrome genauer diagnostizieren und - im Idealfall - therapieren zu können.
Projektleiter: Prof. Dr. Richard Warth

Teilprojekt A7 (Medizinische Physiologie, Physiologie und Pathophysiologie des epithelialen Transports)

Kontrolle des Zellvolumens und epithelialen Transports durch Anoctamine
Anoctamine bilden eine neue Proteinfamilie, die Ca2+-aktivierte Chloridionenkan√§le bilden k√∂nnen, aber auch weitere noch wenig erforschte Eigenschaften besitzen. Diese Proteinfamilie umfasst 10 Mitglieder (TMEM16A-K, Ano1-10). In der ersten Verl√§ngerungsperiode konnten wir zeigen, dass Ano1 in der apikalen Plasmamembran von proximalen Tubulusepithelzellen der Niere exprimiert wird. Dort scheint es die Aktivit√§t der vakuol√§ren H+-ATPase zu kontrollieren und nimmt somit Einfluss auf die proximal-tubul√§re H+-Sekretion und Proteinresorption. Weiterhin scheint Ano1 eine Rolle bei der Entstehung von Nierenzysten zuzukommen. Wir konnten zeigen, dass im Prinzip alle Anoctamine dazu in der Lage sind, Ca2+-aktivierte Cl--Str√∂me zu bilden und dass diese w√§hrend der zellul√§ren Volumenregulation aktiviert werden. Abgesehen von Ano1 und Ano2 sind die physiologischen Funktionen der anderen Anoctamine weitgehend unbekannt. Die pleiotropen Effekte von Anoctaminen auf den Membrantransport, die wir und andere Arbeitsgruppen bislang gefunden haben, betreffen au√üer dem beschriebenen Protonentransport, auch den Ca2+-Einstrom (SOCE), das Scrambling von Membranphospholipiden, die Regulation des Zellvolumens, sowie Zellmigration und Zellproliferation. Au√üerdem produzieren die unterschiedlichen Anoctamine auch Kationenstr√∂me, was momentan unverstanden ist. Wir wollen die Hypothese untersuchen, dass die zellphysiologische und gewebsspezifische, v.a. renale Funktion der Anoctamine nur in Verbindung mit anderen Transportproteinen verstanden werden kann. Die Anoctamine 6 und 10 sind stark in murinen Nieren exprimiert. W√§hrend sich Teilprojekt A12 mit Ano6 besch√§ftigt, wollen wir im vorliegenden Projekt die renale Funktion von Ano10 im Mausmodell und in vitro untersuchen. Durch Zusammenarbeit mit der Universit√§t M√ľnster steht dem Projekt eine gefloxte Ano10 Maus zu Verf√ľgung. Vorarbeiten weisen auf eine molekulare Interaktion von Ano10 mit Aquaporin 3 und dem Eisentransporter Ferroportin-1 hin. Wir wollen daher die funktionelle Interaktion von Ano10 mit diesen Transportproteinen untersuchen und die Rolle von Ano10 und der √ľbrigen Anoctamine f√ľr den volumenregulierten Chloridionenkanal VRAC aufdecken. In Zusammenarbeit mit dem EMBL/Heidelberg werden wir in funktionellen Screens die Wechselwirkung von Ano1, 6 und 10 mit anderen Transportern √ľberpr√ľfen. Zusammen mit dem Teilprojektprojekt A12 erwarten wir a) eine molekulare Einsicht in die Funktionsweise der Anoctamine, b) ein umfassenderes Verst√§ndnis der physiologischen Rolle der Anoctamine in der Niere und c) die molekulare Beschreibung von VRAC.
Projektleiter: Prof. Dr. Karl Kunzelmann

Teilprojekt A8 (Nephrologie / Molekular- und Zellbiologie der Niere)

Intrazellulärer Transport von Polycystin-2 und Domänenanalyse von Polycystin-2 in vivo
Zystennieren werden bei mehreren Erkrankungen beobachtet, die mit Abstand h√§ufigste ist dabei die autosomaldominante polyzystische Nierenerkrankung. Verursacht wird diese durch Mutationen in den Genen PKD1 und PKD2, von denen letzteres f√ľr den nicht-selektiven Kationenkanal Polycystin-2 kodiert. Das Polycystin-2 Protein besitzt sechs Membrandom√§nen und eine Porenregion zwischen der f√ľnften und sechsten Transmembrandom√§ne. Es ist in der Membran des endoplasmatischen Retikulums und der Zellmembran des prim√§ren Ziliums lokalisiert. Der Transport des Proteins vom Ort der Synthese (endoplasmatisches Retikulum) zum wahrscheinlichen Erfolgsorgan (prim√§res Zilium) scheint unkonventionellen Mechanismen zu folgen, denn wir haben herausgefunden, dass Polycystin-2 nicht den Golgi-Apparat durchl√§uft. Eine wichtige Rolle spielt dabei das mit dem COOH-Terminus von Polycystin-2 interagierende Protein PIGEA-14, welches auch mit GM130, einem Protein der Golgi-Matrix, interagiert und zur Umverteilung von Polycystin-2 in der Zelle f√ľhrt.

(i) In einem Zwei-Hybrid-Screen mit PIGEA-14 als K√∂der haben wir weitere Interaktionspartner von PIGEA-14 identifiziert, welche Aufschl√ľsse √ľber seinen Wirkmechanismus zulassen. Die biochemische, zellbiologische und funktionelle Charakterisierung der Interaktionspartner wird im Zentrum des Arbeitsprogramms 1 stehen.
(ii) Unsere Vorbefunde zeigen, dass die Bewegung von Polycystin-2 im prim√§ren Zilium selber durch aktiven Transport erfolgt. Die Identifizierung der f√ľr den Transport verantwortlichen Dom√§nen im NH2-Terminus von Polycystin-2 sowie die molekulare Aufkl√§rung der Transportmechanismen werden uns weitere wichtige Aufschl√ľsse √ľber dieses Protein geben.
(iii) Im dritten Arbeitsprogramm schlie√ülich wird die Charakterisierung zweier Pkd2 Knock-in M√§use vorangetrieben. Sowohl die Knock-in Maus mit einem verk√ľrzten Polycystin-2 Protein als auch die Knock-in Maus mit ver√§nderten Kanaleigenschaften entwickeln Nierenzysten, und zwar mit einer jeweils sehr eigenen Dynamik. Der Pathomechanismus der Zystenentstehung in den beiden Knock-in Mutanten wird √ľber einen genetischen Zugang sowie durch zellbiologische, biochemische und elektrophysiologische Techniken aufgekl√§rt.
Projektleiter: Prof. Dr. Ralph Witzgall

Teilprojekt A10 (Innere Medizin, Nephrologie)

Entwicklung von Fibrozyten und ihr Beitrag zur Kollagenproduktion
Nierenfibrose ist die gemeinsame Endstrecke einer Vielzahl von Nierensch√§digungen und betrifft sowohl das Interstitium als auch die Glomeruli. Fibrose stellt bei vielen Nierenerkrankungen einen negativen prognostischen Marker dar, wobei unklar ist, ob Fibrose nur Ausdruck einer fortgeschrittenen Sch√§digung ohne ad√§quate Regeneration ist, oder per se zur Funktionseinschr√§nkung noch intakter Nephrone f√ľhrt. Experimentelle Daten im Mausmodell deuten darauf hin, dass in der Niere drei verschiedene zellul√§re Mechanismen an der Entstehung einer Nierenfibrose beteiligt sind. Dies sind mesenchymale Zellen (Fibroblasten / Perizyten), kollagenproduzierende h√§matopoietische Zellen (Fibrozyten) und epitheliale / endotheliale Zellen, die sich in mesenchymale Zellen transformieren k√∂nnen (EMT / EndoMT). Welchen Beitrag die einzelnen Zellen zur Entstehung einer Nierenfibrose und insbesondere zur Produktion von Kollagen / Bindegewebe leisten ist bis dato unklar. Durch zelltyp-spezifische Deletion von Kollagen I soll diese Frage beantwortet und gleichzeitig untersucht werden, ob eine verminderte Kollagenproduktion zu einer verringerten Nierensch√§digung und besseren Regeneration f√ľhrt. Im Einzelnen sollen folgende Fragen beantwortet werden:
1. Aus welcher hämatopoietischen Zellreihe und aus welchen Vorläuferzellen entstehen Fibrozyten?
2. Welchen Anteil haben mesenchymale, epitheliale und hämatopoietische Zellen an der Produktion von Kollagen Typ 1 im Nierenfibrosemodell der einseitigen Ureterligatur?
3. Stellt die Produktion von Kollagen Typ 1 einen eigenständigen Schädigungsmechanismus dar?
Projektleiter: Prof. Dr. Matthias Mack

Teilprojekt A11 (Physiologie, funktionelle Genomik)

Mutationen des Fanconi-assoziierten Proteins 2 (FAP2) als Ursache einer erblichen Tubulopathie
In der letzten F√∂rderperiode haben wir ein peroxisomales Protein untersucht, dessen Mutation zu einem isolierten renalen Fanconi-Syndrom f√ľhrt. Unser Kooperationspartner Prof. Robert Kleta (University College London) hat mittels Kopplungsanalyse (LOD Score > 3) ein weiteres Gen gefunden, welches ebenfalls ein renales Fanconi-Syndrom verursacht. Bei diesem zweiten Genprodukt handelt es sich um ein mitochondriales Protein, welches von uns als Fanconi-assoziiertes Protein 2 (FAP2) bezeichnet wird. Die Erkrankung zeigt komplette Penetranz und wird autosomal dominant vererbt.
Ziel dieses Antrags ist die Erforschung der molekularen Ursachen dieser neuartigen Nierenerkrankung. Bei renalen Fanconi-Syndromen handelt es sich um tiefgreifende Störungen des proximalen Tubulus, die ganz unterschiedliche Pathogenesen aufweisen können. Aufgrund der intrazellulären Lokalisation von FAP2 stehen bei der Aufklärung des Pathomechanismus die Mitochondrien im Mittelpunkt.
Die Erkrankung kann relevante Erkenntnisse √ľber die Pathogenese dieses renalen Fanconi-Syndroms liefern. Ferner wird ein besseres Verst√§ndnis der molekularen Krankheitsursachen dabei helfen, symptomatische Therapien f√ľr die betroffenen Patienten zu entwickeln.
Projektleiter: PD Dr. Markus Reichold / Dr. Jörg Reinders / Prof. Dr. Richard Warth

Teilprojekt A12 (Medizinische Physiologie, Physiologie und Pathophysiologie des epithelialen Transports)

Anoctamin 6 ‚Äď ein ubiquit√§res Protein mit Expression in der Niere
Anoctamine formen eine neue Proteinfamilie, die Ca2+-aktivierte Chloridkanäle bilden können. Diese Proteinfamilie umfasst 10 Mitglieder (TMEM16A-K, Anoctamin 1-10). Die Proteine werden nicht nur mit Ca2+ aktivierten Chloridkanälen, sondern auch mit verschiedensten anderen zellulären Funktionen in Verbindung gebracht. In der ersten Verlängerungsperiode konnten wir zeigen, dass Anoctamin 1 (Ano1) in der apikalen Plasmamembran von proximalen Tubulusepithelzellen der Niere exprimiert wird. Dort dient es der Regulation der Säuresekretion und ist bei der Proteinresorption beteiligt. Weiterhin scheint Ano1 eine Rolle bei der Entstehung von Nierenzysten zuzukommen. Wir konnten zeigen, dass im Prinzip alle Anoctamine dazu in der Lage sind Ca2+-aktivierte Cl-- Ströme zu bilden. Abgesehen von Ano1 und Ano2 sind die physiologischen Funktionen der anderen Anoctamine jedoch weitgehend unbekannt.

F√ľr Ano6 konnten wir bislang zeigen, dass dieses Anoctamin eine wesentliche Komponente des lange gesuchten ausw√§rts gleichrichtenden Chloridkanals ORCC bildet. Dieser Kanal wird zudem durch Zellschwellung, sowie durch sehr hohe intrazellul√§re Ca2+- Konzentrationen aktiviert. Ano6 ist weiterhin f√ľr das Ca2+- induzierte Scrambling von Membranphospholipiden verantwortlich, welches zu einer Exposition von Phosphatidylserinen in der √§u√üeren Phospholipidschicht der Zellmembran f√ľhrt. Weitere Vorarbeiten lassen eine Beteiligung bei der polyzystischen Nierendysplasie vermuten.

Ano6 zeigt eine deutliche Expression in der Niere und vielen anderen Geweben. Die Expression von Ano6 ist auf die basolaterale Seite von Epithelzellen des distalen Nephrons und auf das Epithel der Bowmankapsel begrenzt. Auch NCX1 wird reichlich auf der basolateralen Seite von Tubulusepithelien exprimiert. √úber die tats√§chliche Funktion von Ano6 besteht weitgehend Unklarheit. Wir wollen die Rolle von Ano6 f√ľr den glomerul√§ren und den tubul√§ren Ionentransport mit Hilfe einer Ano6 defizienten Maus untersuchen. Im Two-Hybrid/Split-Ubiquitin-System wurden Interaktionen mit dem elektrogenen Na+/Ca2+-Austauscher NCX1 sowie dem Lipidtransporter SCP-2 gefunden, was viele der bisherigen Ergebnisse erkl√§ren k√∂nnte. Das Fehlen einer Ano6-abh√§ngigen Aktivierung von NCX1 k√∂nnte den Defekt der Knochenmineralisierung in Ano6-defizienten M√§usen erkl√§ren, da NCX1 eine Bedeutung sowohl f√ľr die renale Ca2+-R√ľckresorption in der Niere, als auch f√ľr die Osteoblastenfunktion und die Mineralisierungsvorg√§nge im Knochen hat. In der laufenden F√∂rderperiode wurden die molekularen Werkzeuge generiert, um diesen Fragen experimentell weiter nachzugehen. Zus√§tzlich zu der vorhandenen Ano6-defizienten Mauslinie, wird in Zusammenarbeit mit weiteren Arbeitsgruppen eine Ano6/LoxP Mauslinie generiert, um einen gewebsspezifischen Knockout herstellen zu k√∂nnen. Die geplanten Experimente sollen ein Verst√§ndnis der biologischen Funktion von Ano6 erm√∂glichen und dessen Funktion bei renaler Ca2+-Resorption, Knochenmineralisierung durch Osteoblasten und dem Phospholipidscrambling von Membranen aufdecken. Schlie√ülich soll in Zusammenarbeiten mit weiteren Arbeitsgruppen innerhalb und au√üerhalb des SFB699 eine m√∂gliche Beteiligung von Ano6 bei der Entstehung von Nierenzysten untersucht werden.
Projektleiter: Prof. Dr. Rainer Schreiber

Teilprojekt A13 (Anatomie, Entwicklungsbiologie)

Die Nephrozyten von Drosophila melanogaster als Modellsystem zu einem besseren Verständnis der Podozytendifferenzierung und -funktion
Das Teilprojekt gliedert sich in zwei Unterprojekte: Erstens ein besseres Verständnis des Filtrationsapparates in Drosophila und zweitens die Untersuchung der Funktion der Zellpolaritätsproteine PATJ (Pals1-Associated Tight Junction protein) und MUPP1 (Multiple PDZ-containing Protein 1) im Mausmodell.

1. F√ľr die Reinigung der H√§molymphe in Drosophila existieren im Gegensatz zur Niere der Vertebraten zwei getrennte Systeme: W√§hrend der tubul√§re Anteil (die Malpighischen Gef√§√üe) direkt in den (End-)Darm m√ľndet, liegen die Nephrozyten als einzelne Zellen direkt in der Leibesh√∂hle der Fliege und filtrieren Toxine aus der H√§molymphe in eine lakunenartige Einst√ľlpung, die durch eine der Schlitzmembran von S√§ugern homologen Struktur begrenzt wird. Aus dieser Einst√ľlpung werden die Toxine anschlie√üend endozytiert und lebenslang (= bis zu 60 Tage) intrazellul√§r gespeichert, um somit inaktiviert zu werden. √úber Nephrozyten ist noch relativ wenig bekannt, aber verschiedene Erkenntnisse haben eine Homologie zu Podozyten in S√§ugetieren gezeigt.
Um diese Zellen hinsichtlich ihrer Entwicklung, Polarisierung und Funktion genauer zu charakterisieren, wollen wir zun√§chst die Expression und Lokalisation von Polarit√§tsdeterminanten untersuchen, welche bereits in epithelialen Zellen gut charakterisiert sind. Dies erfolgt mittels zellbiologischer (Immunofluoreszenzen) und elektronenmikroskopischer (Immuno-EM, Photokonversion-EM, Kooperation mit Prof. Witzgall (A1) und Z2) Techniken. Die Rolle dieser Proteine/Gene f√ľr Funktion und Morphologie der Nephrozyten soll anschlie√üend durch gerichtete RNA-Interferenz bzw. durch Analyse von mutanten Zellpopulationen in vivo analysiert werden. Dabei wird v.a. die Ultrastruktur (EM) und die Funktion (Absorption verschieden gro√üer Fluorochrome durch die Nephrozyten sowie Inaktivierung von Toxinen) analysiert.
Schlie√ülich soll ein Genom-weiter Screen mittels RNA-Interferenz durchgef√ľhrt werden, bei dem durch das UAS/GAL4-System ausschlie√ülich in Nephrozyten die mRNA eines Gro√üteils der Drosophila-Gene einzeln herunterreguliert wird. Als einfacher Readout wird die Aufnahme von Fluorochromen verschiedener Gr√∂√üe sowie die Vitalit√§t nach Toxingabe verwendet. Positive Kandidatengene werden dann mittels EM und funktionellen Assays weiter charakterisiert.
2. In Drosophila konnten wir bereits zeigen, dass das hochkonservierte Protein PATJ nicht essentiell f√ľr die Etablierung und Erhaltung der Zellpolarit√§t per se ist, sondern Myosin bindet und dessen Phosphorylierung und damit seine Aktivierung reguliert. Dar√ľber tr√§gt PATJ indirekt zur Stabilisierung der apikalen Zell-Zell-Kontakte bei.

In dem beantragten Projekt wollen wir untersuchen, welche Funktion PATJ in Podozyten von S√§ugetieren in vivo hat. Dies ist insbesondere f√ľr die Differenzierung der Podozyten interessant, da es hier zu umfangreichen Umstrukturierungen des Zytoskeletts kommt und auch die Ausbildung und der Erhalt der Schlitzmembran von Myosin-vermittelter Zellkontraktilit√§t abh√§ngig ist.
Daf√ľr werden wir eine konditionelle INADL(das Mausgen, welches f√ľr PATJ kodiert)-Knock-out Maus etablieren und ihren ubiquit√§ren und v.a. Podozyten-spezifischen Knock-out Ph√§notyp charakterisieren. Da ein weiteres Gen (MUPP1) eine starke Homologie zu Drosophila PATJ aufweist soll ein weiteres konditionelles Knock-out Mausmodell etabliert werden, um die Ph√§notypen eines MUPP1 Knock-outs bzw. eines kombiniertes Knockouts von INADL und MUPP1 in Podozyten zu analysieren.
Dar√ľber hinaus sollen mit biochemischen und zellbiologischen Methoden die Mechanismen untersucht werden, wie genau PATJ das Zytoskelett von Podozyten beeinflusst und welche Rolle seine bekannten Bindungspartner (z.B. PAR3, aPKC, Pals1 und Crumbs) dabei spielen.
Projektleiter: Jun.-Prof. Dr. Dr. Michael Krahn

Teilprojekt A14 (Nierenfunktion, Zellbiologie, Biochemie)

Die Bedeutung von MicroRNAs f√ľr die Struktur und Funktion von Podozyten
Die Inaktivierung der f√ľr Dicer und Drosha kodierenden Gene in M√§usen hat gezeigt, dass regulative microRNAs sowohl f√ľr die Nierenentwicklung als auch f√ľr die Aufrechterhaltung der renalen Strukturen und Funktionen von gro√üer Bedeutung sind. Mittlerweile ist eine Vielzahl renaler miRNAs identifiziert. Da bislang jedoch kaum Zielgene spezifischer miRNAs beschrieben sind, ist √ľber ihre (patho)physiologische Rolle in der Niere nur sehr wenig bekannt. Ziel des Projektes ist deshalb die Identifizierung podozyt√§rer miRNAs und ihrer spezifischen Ziel-mRNAs (miRNA-mRNA-Paare), die f√ľr die komplexe Struktur und Funktion der Podozyten wichtig sind. Dar√ľber hinaus werden wir die Rolle von miRNAs bei pathophysiologischen Prozessen in der Niere aufkl√§ren.

Im Rahmen von Vorarbeiten konnte mittels deep sequencing-Analysen ein validiertes miRNA-Profil frisch isolierter Podozyten der Maus erstellt werden. Au√üerdem wurden unter Verwendung verschiedener Algorithmen Bindestellen mehrerer podozyt√§rer miRNAs in den f√ľr wichtige Strukturproteine der glomerul√§ren Schlitzmembran kodierenden mRNAs vorhergesagt. Die Fundiertheit unseres Ansatzes konnte bereits mit Hilfe der Argonaute-Immunpr√§zipitation best√§tigt werden.
Projektleiter: Prof. Dr. Gunter Meister / Dr. Melanie Zaparty

Teilprojekt A15 (Biochemie, Biophysik, Strukturbiologie)

Strukturuntersuchung der Ca2+-abhängigen Kationenkanäle Polycystin-­2 und TMEM16F mittels 2D und 3D Kristallisation und Kryo­-Elektronenmikroskopie
Ca2+-abh√§ngige Ionenkan√§len sind in der Niere essentiell in physiologische Prozesse involviert. Trotz ihrer medizinischen Relevanz ist der Transportmechanismus der meisten Kan√§le jedoch weitgehend unbekannt, da funktionelle Untersuchungen auf Grund der lokalisierungsabh√§ngigen Str√∂me und der regulativen Interaktionen mit anderen Proteinen oft nur schwer durchf√ľhrbar sind. Hochaufgel√∂ste Strukturdaten k√∂nnten hierbei wichtige Einblicke in die Funktionsweise dieser Ionenkan√§len auf molekularer Ebene geben, und in Kombination mit Strukturuntersuchungen auf zellul√§rer Ebene bspw. mit Hilfe von Elektronenmikroskopie neue Anhaltspunkte f√ľr physiologische Untersuchungen in vitro und in vivo liefern.
In diesem Teilprojekt konzentrieren wir uns auf zwei Kan√§le, den TRP-Kanal Polycystin-2 und den Anacotamin-Kanal TMEM16F. Punktmutationen in Polycystin-2 sind ma√ügeblich an der Ausbildung der autosomal-dominaten polyzystischen Nierenerkrankung (ADPKD) beteiligt. Es wird vermutet, dass funktionelle Wechselwirkungen mit dem Interaktionspartner Polycystin-1, die zur Ausbildung eines Polycystin-1/Polycystin-2 Komplexes im prim√§ren Zilium f√ľhren durch diese Mutationen nachhaltig gest√∂rt werden. TMEM16F geh√∂rt einer erst k√ľrzlich entdeckten Familie von Ca2+ aktivierten Kan√§len an, welche ubiquit√§r in den meisten Zellen des K√∂rpers exprimiert werden, u.a. auch in der Membran von Zilien im olfaktorischen Epithel. TMEM16F Kan√§le erzeugen einen Volumen-regulierenden Chlorid-Strom und eine erh√∂hte Expression wurde mit verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht. Es konnte k√ľrzlich gezeigt werden, dass die Expression von TMEM16F bei ADPKD besonders erh√∂ht ist. Weiterhin wird vermutet, dass TMEM16F auch als Phospholipid Scramblase arbeiten k√∂nnte.

Zum Verständnis von Polycystin-2 und TMEM16F ist deren drei-dimensionale Struktur unbedingt notwendig. Im Rahmen dieses Antrages wollen wir durch die Kombination von mehreren strukturbiologischen und biophysikalischen Methoden - zwei-dimensionaler (2D) Kristallisation und Elektronen-Kristallographie, drei-dimensionaler (3D) Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse, Einzelteilchen-Analyse und Kryo-Elektronenmikroskopie, Kryo-Elektronentomographie und Kleinwinkelstreuung - sowohl die Struktur von Polycystin-2 und die medizinisch relevante Interaktion mit Polycystin-1 untersuchen als auch die dualen Ionen- und Lipidbindungen in TMEM16F Kanälen auf molekularer Ebene beschreiben.
Projektleiter: Prof. Dr. Christine Ziegler